Etablierung eines PCR- und Sequenzierungsprotokolls zur Untersuchung des ATM-Gens bei Brustkrebs

2019LgMkShDs

Projektbetreuer: Frau Dr. C. Schultheis
Projektteam:  Luke Genske, Moritz Kämmerer, Sebastian Haroun, Danny Siwek
Projekt-Phase:  September 2019-Januar 2020



Kurzfassung: Krebserkrankungen stellen einen beträchtlichen Anteil der Krankheitslast in Deutschland dar. Es werden hier jährlich ca. 500.000 Neuerkrankungen dokumentiert. (Egermeier, 2015) Der Brustkrebs (Mammakarzinom) ist die häufigste Krebserkrankung der Frau und tritt meist bei Personen zwischen dem 40. und 70. Lebensjahr auf. (Bach et al., 2007, S.1169) Es besteht ein enger Zusammenhang zwischen ATM-Mutationen , dem Louis-Bar-Syndrom und neoplastischen Erkrankungen. (Nicke et al., 1999, S.22-24) Mit dem Louis-Bar-Syndrom zugrunde liegenden Mutationen und weiteren ATM-Defekten wird unter anderem ein erhöhtes Brustkrebsrisiko in Verbindung gebracht. (Hiddemann et al., 2010)

Eine molekularbiologisch-genetische Diagnostik kann Aufschluss über das Risiko für das Auftreten von Krebserkrankungen liefern. Fundierte Erkenntnisse über den genetischen Status eines Patienten kann die Gensequenzierung nach Sanger bringen. Ziel dieser Projektarbeit war es, ein für die Diagnostik geeignetes Protokoll zur Sequenzierung des humanen ATM-Gens zwecks Einschätzung eines erhöhten Brustkrebsrisikos aufgrund von ATM-Mutationen zu etablieren. Hierbei wurde auf das Konzept nach einer Primerkonzeption in silico für die entsprechenden codierenden Exons (inkl. Erfassung wichtiger Intronsequenzen) mit den Verfahren genomische DNA-Isolierung/ -Aufreinigung, Polymerasekettenreaktion, Gelelektrophorese und Sanger-Sequenzierung praktisch umgesetzt; die konzipierten Primer wurden somit auf Funktionalität überprüft. 

Es ist gelungen, die Funktionalität nahezu aller Primerpaare zu belegen. Ebenfalls konnte in der Mehrheit der Exons eine Sequenzierung nach Sanger erfolgreich durchgeführt werden. Im Falle weniger Exons ist die Sequenzierung bis zum Abschluss der Praxisphase dieser Projektarbeit nicht gelungen. 

Zusammenfassend ist festzuhalten, dass die konzipierten Primerpaare sowie das Arbeitsschema als Grundlage für die standardmäßige Etablierung eines Sequenzierprotokolls für das humane ATM-Gen herangezogen werden kann. Voraussetzung hierfür ist eine Neukonzeption von Primern mit mangelhaften Ergebnissen und eine Optimierung der Sequenzierparameter in weiterführenden Versuchsreihen.
Abstract:

Cancer represents a considerable proportion of the disease burden in Germany. Approximately 500.000 new cases are documented every year. (Egermeier, 2015) Breast cancer is the most common cancer concerning women and mostly occurs in people between the ages of 40 and 70. (Bach et al., 2007, p.1169) There is a close relationship between ATM mutations, Louis-Bar syndrome and neoplastic diseases. (Nicke et al., 1999, p.22-24) An increased risk of breast cancer is assumed in the case of ATM-defects and Louis-Bar syndrome. (Hiddemann et al., 2010)

Molecular biological-genetic diagnostics can provide information about the risk of cancer. Gene sequencing according to Sanger can provide well-founded information about the genetic status of a patient. 

The aim of this project was to establish a protocol for sequencing of the human ATM gene, suitable for use in human genetic diagnostics to estimate the breast cancer risk. After primer design in silico for the corresponding coding exons (incl. acquisition of important intron sequences), the concept was implemented with the methods genomic DNA isolation/ purification, polymerase chain reaction, gel elektrophoresis and Sanger sequencing; the designed primers were tested for functionality. 

The functionality of almost all primer pairs has been successfully proven. Also, Sanger sequencing was successfully performed in the majority of exons. In the case of a few exons, sequencing was not successful until the practical phase of this project was completed. In summary, the primer pairs as well as the scheme can be used as a basis for the standard establishment of a sequencing protocol for the human ATM gene. Prerequisite for this is a new conception of primers with poor results and an optimization of the sequencing parameters in further test series. 
   

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